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本试剂盒采用改良的SDS-碱裂解法，结合先进的硅胶膜吸附技术，可达到快速纯化质粒DNA的目的。适用于从1～4mL的细菌培养物中提取多至20μg高纯度的质粒DNA，提取的质粒DNA可用于酶切、PCR、测序、细菌转化、体外转录与翻译等分子生物学实验。

• 操作简便：在30min内可完成多个样品的质粒DNA提取。
  
• 高效提取：可提取菌体85%以上的质粒DNA。

本试剂盒适用于从1～4mL的细菌培养物中提取多至20μg高纯度的质粒DNA。

• Buffer P1在使用前先加入RNase A（试剂盒中提供的RNase A全部加入），混匀后置于2～8℃保存。
  
• 第一次使用前，向Buffer W1中加入无水乙醇，加入量参见瓶上标签。
  
• 当环境温度低时，Buffer P2中的SDS可能出现浑浊或析出沉淀，将其37℃水浴加热几分钟即可恢复澄清，请勿剧烈摇晃，以免形成泡沫。
  
• Buffer P3中含刺激性溶液，操作时要戴乳胶手套、口罩和眼镜。若沾染皮肤、眼睛应立即用大量清水或生理盐水冲洗，必要时及时就医。
  
• 各溶液使用后请立即盖紧盖子。
  
• 质粒提取得率和质量与宿主菌的种类、质粒拷贝数、质粒的稳定性等因素有关。

• 取1～4mL过夜培养的菌液，12000×g离心1min，收集菌体，尽量吸除上清。
  
• 加入250μL Buffer P1（请先检查是否已加入RNase A）重悬菌体沉淀（若菌体沉淀未彻底悬浮会影响裂解效果，导致提取得率和纯度偏低），涡旋震荡至无菌块为止。
  
• 加入250μL Buffer P2，温和地上下翻转6～8次，使菌体充分裂解。
  
  此步需要温和翻转，不能剧烈震荡，以免打断基因组DNA，使提取的质粒中含有基因组DNA片段。混合后菌体应变得清亮粘稠，若未变得清亮，可能是由于菌体量过多，裂解不充分导致，应减少菌体量。
• 加入350μL Buffer P3，温和地上下翻转6～8次，充分混匀（此时会出现白色絮状沉淀），12000×g离心10～15min。
  
• 小心吸取上清，将上清转入吸附柱EC中（注意不要吸出沉淀），12000×g离心1min，弃废液，将吸附柱EC放回空收集管。
  
• 在吸附柱EC中加入600μL Buffer W1（请先检查是否已加入指定体积的无水乙醇）12000×g离心1min，弃废液。
  
• 重复步骤6。
  
• 将吸附柱EC放回空收集管中，12000×g离心2min。
  
• 取出吸附柱EC，放入干净的1.5mL离心管中，室温开盖静置2min，使残留的乙醇挥发。在吸附膜的中间部位加入35～50μL洗脱缓冲液（60～65℃预热洗脱缓冲液效果更好），室温静置2min，12000×g离心2min。如需较多量DNA，可将得到的溶液重新转入吸附柱EC中，离心2min。
  
  洗脱体积越大，洗脱得率越高，如需得到较高浓度的DNA，可以适当减少洗脱体积，但最小体积不应少于25μL，体积过小会降低DNA洗脱得率，降低产量。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，建议ddH2O洗脱，并保证其pH值在7.0～8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

• 质粒DNA产量低？
  
  • 质粒拷贝数低。载体因拷贝数差异会造成质粒产量明显的波动。高拷贝数的载体常有2～3倍的产量波动（每毫升培养过夜的菌液，高拷贝数的质粒载体产量为3～16μg）。长片段质粒和表达型载体常以中低拷贝数为主，每毫升菌液的产量约为0.5～2μg。
    
    • 低拷贝质粒：pBR322,pACYC及其衍生载体，pSC101及其衍生载体，SuperCos,pWE15。
      
    • 高拷贝质粒：pTZ,pUC,pBS,pGM-T。
  • 菌种问题。菌种保存过程中存在质粒丢失现象，培养细菌前最好先划线活化，以稳定产量。
    
  • 细菌未充分裂解。细菌须在Buffer P1/RNase A中充分重悬，成团的细菌因无法裂解会降低产量。
    
  • 试剂准备有误。Buffer P2若有沉淀析出需加热溶解，Buffer W1加入乙醇体积不准确。
    
  • 洗脱效率低。将洗脱缓冲液预热至60～65℃，并进行二次洗脱。
• 质粒DNA中有基因组DNA污染？
  
  • 菌液培养时间太长。菌液培养时间需控制在12～16h。
    
  • 裂解问题。加入Buffer P2时，必须轻柔颠倒混匀；处理多个样品时，加入Buffer P2时算起，总时间不要超过5min。